Мир перевернулся…Пришествие Прионов

… если не мир, то, по крайней мере, многие традиционные представления молекулярной биологии. И произошло это благодаря приону — недавно открытому патогену белковой природы.
Ради него, приона, 14 июля 2001 года в Харькове была проведена научно-практическая конференция «Прионы: биологические свойства, роль в инфекционной патологии животных и человека», инициаторами которой выступили В. П. Черных, чл.-корр. НАН Украины, ректор Национальной фармацевтической академии Украины, И. Л. Дикий, профессор, заведующий кафедрой микробиологии той же академии и И. С. Кратенко, главный санитарный врач Харьковской области.

Неопровержимые доказательства

Заболевания человека и животных, ныне называемые прионными, известны давно.

Первое упоминание о скрейпи овец датируется 1732 годом. Прионные болезни у человека обнаружены в начале века. Но доказательства их инфекционности удалось получить гораздо позже.

Впервые об инфекционном генезе скрейпи заговорили в 1946 году, когда после иммунизации стада овец часть привитых животных заболела. Несколько позже выяснилось, что причиной эпидемии стал инфекционный агент, содержавшийся в сыворотке, полученной из больного животного.

Остальные доказательства были получены при изучении природы двух нейродегенеративных заболеваний человека — болезни Крейцфельда—Якобса (БКЯ) и болезни Куру.

Во-первых, в мозге людей, погибших от болезни Крейцфельда—Якобса, удалось обнаружить инфекционный агент, способный вызывать БКЯ у человекообразных обезьян.

А во-вторых, эпидемиологические исследования на островах Новой Гвинеи, где смертельная болезнь Куру буквально «косила» коренное население, унося ежегодно около двухсот человеческих жизней, убедительно доказали: распространение заболевания связано с ритуальным каннибализмом. (Здесь издавна было принято в знак уважения к умершему съедать его.) С прекращением этой традиции в 70-х годах исчезла и эпидемия куру, но редкие случаи болезни Куру встречаются там и сегодня.
Странный инфект

Из всего живого прион погибает последним

Когда выяснилось, что агент скрейпи совершенно свободно проходит через фильтры, задерживающие одноклеточные патогены — бактерии, грибы и т. д. — появилось предположение, что это какой-то особый «медленный вирус».

Но оно потерпело крах: агент оказался устойчивым к химической обработке спиртами и формальдегидом, ультрафиолетовому облучению и γ-излучению.

В то же время инфект был чувствителен к протеазам и воздействиям, денатурирующим практически все белки. Вывод напрашивался сам собой: вопреки всем постулатам молекулярной биологии патоген является инфекционным белком.

Для объяснения необычного поведения инфекционного агента Дж. Гриффит (математик по образованию) выдвинул предположение о том, что агент представляет собой особую измененную форму одного из клеточных белков, способную воспроизводить свои свойства за счет автокаталитического механизма. В дальнейшем эта гипотеза нашла подтверждение в работах Стэнли Прузинера (за которые, кстати говоря, он был удостоен Нобелевской премии).

Проблемой прионов Прузинер заинтересовался в 1972 году после смерти одного из своих пациентов от деменции, вызванной БКЯ. Десять лет спустя ему удалось выделить сам прион (PRоtein INfectious agent) — видоизмененную форму нормального клеточного протеин-приона (PrP) млекопитающих и птиц, кодируемого одним геном.

По аминокислотной последовательности инфекционный белок ничем не отличался.

Единственное различие между ними заключалось в конформации: у патогена выявилось преобладание b-складчатой структуры. Именно оно и вызывало кардинальное изменение свойств нормального клеточного белка, делая его более устойчивым к действию протеаз. Кроме того, у инфекционного белка ярче проявлялась гидрофобность и склонность к образованию агрегатов.

У человека этот белок с молекулярной массой 33-35 кД состоит приблизительно из 254 аминокислот, включая 22-членный N-терминальный сигнальный пептид, кодируется геном, расположенным в коротком плече 20-й хромосомы. Ген этот обладает полиморфизмом: 50% населения гетерозиготны по кодону 129 (метионин/валин), 40% гомозиготны по метионину и 10% — по валину. Утрату полиморфизма принято считать фактором, определяющим наследственную склонность к возникновению заболевания.

Нормальный протеин-прион главным образом синтезируется в нейронах, хотя продуцировать его могут и многие другие клетки. Функции прион-протеина в организме здорового человека не совсем понятны. Известно только, что он входит в состав наружных клеточных мембран и участвует в эндоцитозе и катаболизме клеток.

Прион-протеин необходим для нормальной синаптической функции. Не исключено, что прионы играют определенную роль в межклеточном узнавании и клеточной активации.

По мнению некоторых специалистов, нормальные прионы способны подавлять процессы старения, чем и объясняется сходство клинических и морфологических характеристик прионовых болезней с геронтологическими заболеваниями.

Аминокислотная последовательность нормального клеточного белка PrP у разных видов млекопитающих и человека почти не отличается, что указывает на возможность передачи прионных заболеваний от животных к людям, в том числе и через зараженное мясо. (Любопытно, что собаки обладают какой-то загадочной устойчивостью к прионным болезням, и с чем она связана, совершенно непонятно).

Сейчас, когда в некоторых европейских странах зарегистрированы эпидемии бычьей энцефалопатии, этому вопросу стали уделять особое внимание.

И хоть на самом деле вероятность передачи этой патологии человеку крайне низка: в мире насчитывается не более 20 случаев, в которых предполагается заражение людей бычьей энцефалопатией, во многих странах вводятся меры по предупреждению потенциальной опасности. Международный зоосанитарный кодекс запрещает не только импорт костной муки, но и ввоз эмбрионов и спермы племенного скота из стран риска (хотя по некоторым данным, прионная инфекция не может передаваться через сперму).

Во всех странах риска существует запрет на производство костной муки из зараженных животных и запрет на использование субпродуктов. В Англии, кроме того, исследуется мозг всего рогатого скота. Молоко считается безопасным, хотя в последнее время стали появляться сообщения, что употребление молока тоже может иметь печальные последствия.

Необычное поведение

Каким бы путем не вводились патологические прионы, вначале они обязательно появляются в клетках лимфо-ретикулярной системы миндалин, тимуса, лимфатических узлов и селезенки, сосредотачиваясь в основном в В-клеточных зонах лимфоидных тканей. Здесь, в лимфатических органах, возможна и частичная репликация прионов. Дальнейшая нейроинвазия прионов происходит с участием дифференцированных В-лимфоцитов. (Не исключено, что это свойство дифференцированных В-лимфоцитов можно будет использовать для профилактики и терапии прионных заболеваний.)

Но вернемся к прионам. Из органов иммуногенеза они по нервам устремляются к ближайшим аксонам. Там число прионов увеличивается до некого критического уровня. После чего они начинают передвигаться по направлению к спинному, а затем головному мозгу. Справедливости ради, надо сказать, что репродукция прионов осуществляется не только в нейронах, но и в глиальных элементах.

А то, что на поздних стадиях заболевания отмечается значительное повышение уровня цитокинов, по мнению некоторых специалистов, свидетельствует о ключевой роли астроцитов и других клеток глии в патогенезе прионной инфекции.

Инфицированность органов иммуногенеза по всем существующим канонам подразумевает перенос инфекционного агента с кровью. Но, как ни странно, даже в самый разгар болезни, не говоря уже об инкубационном периоде и доклинической стадии, никаких сдвигов в периферической крови не наблюдается.

На сегодняшний день известно несколько путей «проникновения» патогенного приона в организм: интрацеребральный, интравенозный, интраперитонеальный, подкожный, оральный. Чем длиннее дорога приона до конечного пункта назначения — головного мозга, тем больше доза вводимого инфекта. К примеру, доза, необходимая для заражения прионами мышей при оральном пути должна быть в 200 000 (!) раз выше, чем при интрацеребральном.
Гипотезы, гипотезы…

То, что прионные болезни обусловлены переходом нормального клеточного белка PrP в качественно новое патогенное состояние, сомнений уже ни у кого не вызывает. Но сам механизм перехода еще не совсем понятен, хотя для его объяснения и выдвигается множество самых разнообразных гипотез. Наибольшее признание среди специалистов получили две модели — гетеродимерная модель Прузинера и полимеризационная модель.

Согласно гетеродимерной модели Прузинера, патогенный белок, проникая в клетку, образует комплекс со своим нормальным клеточным собратом. В результате конформация нормального клеточного белка меняется, и он приобретает свойства приона. Агрегация в модели Прузинера рассматривается как вторичный процесс, не имеющий существенного значения для прионообразования. В полимеризационной модели, наоборот, ведущая роль отводится агрегации белков.

В этой модели прион — упорядоченный полимер PrP, подобно мельчайшим кристалликам в перенасыщенном растворе соли, служит затравкой для образования полимерных агрегатов. Причем, присоединение очередной белковой молекулы сопровождается изменением ее конформации.

В отличие от модели Прузинера полимеризационная модель позволяет объяснить наличие различных прионных штаммов: ведь множество различных конформаций мономера, не только обладающих стабильностью, но и способных к точному воспроизведению, даже представить себе трудно, тогда как множество типов укладки белка — экспериментально подтвержденный факт.

Надо сказать, что открытие прионоподобных белков у низших эукариот вынудило увидеть прионы в новом, не совсем обычном свете. Прежде всего, это касается гипотезы о том, что инфекционность прионов — это лишь частный случай проявления уникального механизма передачи конформации между молекулами одного белка.

Вполне вероятно, что прионы млекопитающих и человека, подобно прионам дрожжей и гриба Podospora, могут выступать в качестве определенного звена в адаптационном механизме высших организмов. Способность же к наследуемой регуляции функции прионных белков, по-видимому, могла бы использоваться при клеточной дифференцировке и раковой трансформации.

Не секрет, что дрожжевые прионы очень сильно зависят от активности одного из белков теплового шока, который в норме необходим для разрушения агрегатов денатурировавших белков.

Существует предположение, что этот же белок участвует в фрагментации прионовых фибрилл и поэтому для прионов одинаково губительны как отсутствие, так и избыток этого белка (в первом случае фибриллы вообще не образуются, во втором — образовавшиеся агрегаты разрушаются). Поскольку у млекопитающих тоже есть аналогичный белок, то вполне возможно, что воздействие на ген, ответственный за его синтез, станет одним из перспективных подходов при лечении прионных болезней.

О прионных болезнях

Наиболее изученными прионными заболеваниями человека являются спонгиформные трансмиссивные энцефалопатии.

К ним относится синдром Герстмана—Страусслера—Шейнкера, синдром «фатальной семейной бессонницы», болезнь Куру, хроническая прогрессирующая энцефалопатия детского возраста или болезнь Альперса и болезнь Крейцфельда—Якобса, представленная тремя классическими формами — спорадической, семейной/генетической и ятрогенной. В 1996 году к этому списку добавился британский вариант БКЯ.

Неврологическая симптоматика прионовых энцефалопатий весьма разнообразна. Однако некоторые клинические проявления присущи всем формам губчатой энцефалопатии.

К ним относятся:

расстройства чувствительной сферы — потеря и извращение чувствительности, выпадение функций органов чувств;
нарушения двигательной сферы — атаксия, обездвижение, атрофия мышц, параличи;
нарушения психики — амнезия различной степени утрата профессиональных навыков, депрессия, сонливость, агрессивность, снижение интеллекта, вплоть до полного слабоумия.

Надо сказать, что клинические проявления — по сути единственный прижизненный метод диагностики прионных заболеваний. Других тестов, позволяющих достоверно поставить диагноз, не существует, поскольку развитие заболевания не отражается ни на периферической крови, ни на энцефало-арахноидальной жидкости, ни на электроэнцефалограмме.

Подтвердить клинический диагноз можно лишь посмертно.

Для всех случаев прионовых энцефалопатий характерно незначительное уменьшение массы головного мозга. Иногда (главным образом при длительном течении заболеваний) имеет место умеренная атрофия мозговых извилин. Спинной мозг визуально практически остается неизменным. Крайне редко в нем отмечают существенное уменьшение числа мотонейронов. В периферических нервах никаких выраженных структурных изменений не наблюдается, несмотря на то, что в них «обитает» довольно много прионов.

На основании гистологических исследований мозга выделяют четыре характерных признака губчатой энцефалопатии: спонгиозные изменения, уменьшение числа нейронов, астроцитоз и амилоидные бляшки. Кстати, из-за обилия мелких вакуолей в отростках нейронов и астроцитов мозг становится похожим на губку. Этим и объясняется появление термина «губчатая энцефалопатия».

Отдельные вакуоли присутствуют во всех участках коры мозга. Иногда они сливаются в микроцисты, тем самым искажая цитоархитектонику коры. Вакуолизация может выявляться и в цитоплазме больших нейронов коры. Но особенно много вакуолей обнаруживается в нейропиле серого вещества конечного мозга.

Помимо коры, спонгиозные изменения нейропиля и вакуолизация цитоплазмы нейронов отмечаются по ходу всех полей аммоновых рогов, по ходу зубчатой фасции, в области подкорковых ядер, таламусе и коре мозжечка. Именно вовлечение в патологический процесс мозжечка считается наиболее характерным проявлением губчатой энцефалопатии.

Спонгиозные изменения сопровождаются потерей нейронов различных отделов коры. Причем степень выпадения нейронов коррелирует с выраженностью спонгиформных изменений и соответствует длительности заболевания.

Первые два признака сочетаются с пролиферацией клеток астроглии.

В пролиферирующих астроцитах обнаружены различные дистрофические изменения: от вакуолизации цитоплазмы до появления тучных форм.

В то же время при всех формах прионовых болезней демиелинизация волокон отсутствует.

Очень важным морфологическим признаком прионных энцефалопатий является наличие прион-протеиновых бляшек.

Такие бляшки характерны для болезни Куру. Несколько реже они встречаются при спорадической и семейной формах болезни Крейцфельда—Якобса. При атипической форме БКЯ их обнаруживают более чем в 70% случаев.

Излюбленное место обитания прион-протеиновых бляшек — клетки зернистого слоя коры мозжечка, хотя иногда они могут располагаться в молекулярном слое и в белом веществе. Для идентификации бляшек используют стандартные иммуногистохимические методы с PrP-антителами.

Спорадическая форма болезни Крейцфельда—Якобса встречается на всех континентах, поражая людей разного возраста — от 17 до 82 лет. Заболевание это редкое: средний уровень регистрируемой в мире заболеваемости БКЯ составляет около 0,5–1,0 случаев на 1 млн жителей.

На семейную (генетическую) форму приходится по разным данным от 5–6% до 10–15% всех случаев БКЯ. Развитие болезни чаще всего обусловлено мутацией, приводящей к замене в 178-й позиции молекулы приона аспартатовой кислоты на аспарагин.

Для ливийских евреев, словацких и чилийских общин, где большой популярностью пользуются внутрисемейные браки, семейная форма БКЯ является настоящим бедствием. Правда, некоторые специалисты считают, что высокая заболеваемость ливийских евреев связана не только с особенностями генотипа, но и с особенностями национальной кухни, богатой блюдами из мозга и глаз овец.

В последние годы появились случаи ятрогенной БКЯ, которые подразделяются на две группы в зависимости от типа заражения. Центральное заражение происходит во время операций, хирургических манипуляций, через трансплантаты и хирургический инструмент. Известны 24 случая заражения при пересадке взятой у погибших от БКЯ твердой мозговой оболочки, 1 случай — при пересадке роговицы, 2 случая — после стереотаксической операции. Длительность инкубационного периода после инокуляции варьирует от 7 месяцев до 10 лет.

Все полсотни зарегистрированных случаев периферического заражения (львиная доля которых приходится на Францию) связаны с лечением соматотропином и гонадотропином, полученными из гипофиза человека. При периферическом заражении латентный период может длиться от 18 до 28 лет. Заболевания, связанные с переливанием крови, не зафиксированы. И все же исключать такую возможность нельзя, поскольку в опытах на животных доказана возможность передачи прионной инфекции с кровью.

Британский вариант БКЯ поражает людей молодого возраста. С 1995 по 1997 год было зарегистрировано 15 случаев атипической формы БКЯ: 14 в Великобритании и 1 во Франции.

У всех больных отмечалась гомозиготность по 129 кодону, характерная для спорадических и ятрогенных форм БКЯ. После серии опытов на животных возникло предположение, что необычная форма БКЯ связана с новым фактором риска — употреблением мяса коров, больных губчатой энцефалопатией.

Синдром Герстмана—Страусслера—Шейнкера, как правило, проявляется в 40–50 лет расстройствами глотания и фонации, мозжечковой атаксией и прогрессирующей деменцией. Долгое время этот синдром считали исключительно семейным заболеванием, наследуемым по аутосомно-доминантному типу. Теперь стала известна и его спорадическая форма.

Фатальная семейная бессонница описана относительно недавно, в 1986 году. Эта чрезвычайно редкая, неизлечимая прионная болезнь с аутосомно-доминантным типом наследования. На практике такой тип наследования означает, что обладатель патологического гена заболеет обязательно. Правда, степень выраженности болезни может быть различной.

Клинически выделяют четыре стадии заболевания.

Первая стадия длится около четырех месяцев. Ее основной признак — прогрессивная бессонница. 

На второй стадии, длящейся примерно пять месяцев, появляются галлюцинации и ощущение тревожности.

Третья стадия длится около трех месяцев и характеризуется полной бессонницей.

В четвертой стадии полная бессонница дополняется деменцией. А примерно через полгода больные погибают от истощения или пневмонии.

Все многочисленные проявления этой страшной болезни — снижение эффективности проведения импульсов через таламус, нарушение циркадных ритмов, влияющих на кровяное давление, частоту сердечных сокращений, температуру тела и гормональные ритмы, снижение порога болевой чувствительности и рефлекторной активности, развитие слабоумия — обусловлены дистрофическими изменениями таламуса.

Хроническая прогрессирующая энцефалопатия детского возраста или болезнь Альперса, при которой изменения, характерные для всех спонгиоформных энцефалопатий, затрагивают многие отделы головного мозга, продолжается в среднем 8 месяцев. Клиническая картина характеризуется сильными головными болями, нарушением зрения, множественными инсультоподобными состояниями (с эпилепиформными припадками), прогрессивной гипотонией, поражением печени (хронический гепатит с исходом в цирроз), иногда развивается геморрагический панкреатит. Смерть обычно наступает в результате печеночной недостаточности.

Развивается заболевание в детском и юношеском возрасте (от рождения до 18 лет). Есть даже сведения о развитии болезни Альперса в пренатальный период. В этом случае наблюдается выраженная микроцефалия, задержка внутриутробного развития, акинезия плода, микро- и ретрогнатия, нарушение подвижности суставов.

До недавнего времени хроническая прогрессирующая энцефалопатия считалась наследственным заболеванием с аутосомно-рецессивным типом наследования. Но в последние годы в экспериментах на животных удалось доказать существование инфекционной формы болезни Асперса.

В 1993 году группу прионных заболеваний пополнил спонгиформный миозит с прион-ассоциированными включениями. Чаще всего спогиформный миозит поражает людей старше пятидесяти лет. Он характеризуется медленно прогрессирующей слабостью и миалгией, перед которой бессильна стероидная терапия. Гистологически выявляется некротическая миопатия с наличием вакуолей, которые при электронной микроскопии имеют вид четко ограниченных масс амилоидоподобных филаментов. Иммуногистохимически амилоидные массы состоят из прион-протеинов PrP, Ab-пептидов и аполипопротеина E. Эти же соединения обнаруживаются в мышечных волокнах в виде нитевидных депозитов.

Итоги

Все перечисленные выше аспекты «прионовой проблемы» освещались докладчиками, как правило, на основе литературных данных. У нас, как это ни печально, исследования прионных инфекций практически не ведутся. Поэтому по справедливому замечанию Б. Т. Стегния, заместителя директора по научной работе Института экспериментальной и клинической ветеринарной медицины, академика УААН, конференция носила преимущественно информационный характер. Тем большую заинтересованность присутствующих вызвал доклад Т. И. Коваль (Украинская медицинская стоматологическая академия, г. Полтава) «Опыт выявления прионных инфекций в Полтавской области».

На основе ретроспективного анализа 35 тыс. историй болезней пациентов неврологического и психиатрического диспансеров Т. И. Коваль отобрала 11 «подозрительных» случаев. Дальнейшие гистологические исследования подтвердили верность, поставленного ею диагноза — губчатая энцефалопатия. Так что в Украине, прионные заболевания тоже встречаются. Правда, официальная статистика по этой группе заболеваний человека отсутствует. Впрочем, в равной мере это относится и к губчатым энцефалопатиям животных.

Государственный департамент ветеринарной медицины планирует создание двух Центров по изучению прионов — во Львове и в Харькове. Когда они заработают, сказать трудно. Для этого нужны очень большие деньги. В Германии, к примеру, на изучение прионовой проблемы ежегодно тратится сумма, равная нескольким бюджетам Украины.

Л. В. Львова, канд. биол. наук